□ 연구개요 자가포식(autophagy)은 보존된 세포내 분해기전으로 세포내 불필요한 물질 예를 들어 수명을 다한 단백질, 세포소기관, 외부항원 등을 자가포식체라 불리는 이중막으로 둘러싸 격리시키고, 리소좀과 융합하여 내부 물질들을 분해하여 재활용하는 기전이다. 자가포식은 세포의 항상성 유지에 중요하며, 따라서 다양한 생리학적-병리학적인 과정 및 질병에 연관되어 있다. 자가포식 기전에서 중심적인 역할을 하는 LC3/GABARAP family 단백질들은 자가포식에 관여하는 다양한 단백질들이 자가포식 기전에 작용할 수 있게 결합 자리를 제공한다. 자가포식에 관련된 여러 단백질들은 LIR(LC3 Interaction Region) 혹은 GIM(GABARAP Interaction Motif)이라 불리는 특정 아미노산 서열(이하 LIR)을 가지고 있으며, 이를 통해 자가포식체에 존재하는 LC3/GABARAP family 들과 결합하여 작용한다. 이러한 LIR과 LC3/GABARAP family단백질들 간의 결합성을 확인하기 위해서 기존연구에서는 생체 외 결합 실험을 주로 활용하였다. 이에 본 연구자는 생체 내에서 LIR 혹은 GIM과 LC3/GABARAP family단백질들 간의 결합성을 모니터링할 수 있는 새로운 방법을 개발하고, 더 나아가 특이적인 결합성을 보이는 LIR들을 찾고 LIR을 포함하는 결합단백질의 기능적 연구를 하고자 한다. □ 연구 목표대비 연구결과 본 연구는 생체 내에서 LC3/GABARAP family 단백질들과의 결합성을 검증하는 새로운 방법개발과 아직 연구되지 않은 LC3/GABARAP family에 결합하는 새로운 LIR들을 찾고, LIR를 포함하는 결합단백질의 기능을 연구하는 것을 목표로 했다. 1차 목표인 생체 내에서 LIR과 LC3/GABARAP family 단백질들 사이의 결합성을 검증하는 새로운 방법 개발하기 위해, 우선 내제적인 LC3/GABARAP family 단백질 모두가 결핍된 Hela 세포를 활용하여 생체 내 결합성을 모니터링 할 때 작용할 수 있는 부작용 및 영향을 최소화 하였다. 핵으로 위치하게 하는 nuclear localization signal (3xNLS)와 mRFP를 융합시킨 LIR과 GFP-LC3/GABARAP family의 lipidation mutant (Glycine → Alanine)를 제작하였다. 이를 같이 세포에 발현시켜 핵의 GFP 형광 정도를 측정함으로써 unlipidated LC3/GABARAP family 단백질들 과 LIR의 결합성을 측정하였다. 또한 lipidated LC3/GABARAP family 단백질에 대한 LIR의 결합성을 확인하기 위해 GFP형광이 융합된 LIR과 mRFP가 융합된 LC3/GABARAP family를 같이 세포에 발현시켜 자가포식을 유도하여 생성된 자가포식체의 GFP 형광 정도로 결합성을 측정하였다. 위의 두 방법을 통해 대체가능한 새로운 생체 내 모니터링 방법을 확립하였다. 2차 목표인 본 과제에서 제안한 새로운 방법을 활용하여 기존에 보고되었거나 잠재적인 LIR 들의 경합성을 모니터링 하고 이를 데이터베이스화하기 위해, 또는 특이적인 결합성을 보이는 LIR을 포함하는 결합단백질의 기능적 연구를 진행하기 위해, 출판된 논문과 다양한 문헌조사를 통해 새로운 LIR들의 정보를 찾아 LIR(X)-mRFP-3xNLS 과 LIR(X)-GFP를 제작 하여 모니터링하였다. 다양항 LIR들을 모니터링하여 각 실험 결과를 데이터베이스화하였으며, 새롭게 발견한 특이적인 LIR을 활용한 다양한 연구를 진행하고 있다. □ 연구개발결과의 중요성 - 자가포식 기전은 세포내 다양한 생리학적-병리학적 과정 및 질병에 연관 되어있으며, 세포내 항상성 유지에 중요한 것으로 알려져 많은 연구가 진행되고 있다. 따라서 자가포식에서 중심적인 역할을 하는 LC3/GABARAP family 단백질들에 대한 연구와 다른 단백질의 결합성을 모니터링하고 데이터베이스화 하는 연구는 앞으로의 자가포식 기전연구에 중요한 방법이 될 것이다. - 본 연구를 통해 개발된 새로운 모니터링 방법은 LC3/GABARAP family 단백질들에 대한 특정 LIR 혹은 결합단백질의 결합성을 생체 내에서 직관적으로 관찰 할 수 있으며, 뿐만 아니라 lipidated- 그리고 unlipidated-LC3/GABARAP family 단백질 2가지 형태에 대한 결합성 확인할 수 있어, 자가포식 기전에서 LC3/GABARAP family 단백질을 연구하는 연구자들에게 큰 도움이 될 것이다. - 최근 연구에서 자가포식은 분해하는 물질에 따라 각각의 선택적 자가포식(Selective Autophagy)로 분류되고 있으며, 여기에는 일부 특이적인 결합단백질들과 LC3/GABARAP family 단백질들이 선택적으로 작용한다고 알려졌다. 각 LC3/GABARAP family 단백질에 특이적인 LIR 혹은 LIR을 포함하는 단백질을 발견하고, 이를 활용하여 연구를 진행한다면 선택적 자가포식 기전 그리고 아직 알려지지 않은 LC3/GABARAP family 단백질들의 기능에 대한 연구에 중요하게 사용될 것이다. (출처 : 연구결과 요약문 2p)
- 연구책임자 : 장덕진
- 주관연구기관 : 경북대학교
- 발행년도 : 20200600
- Keyword : Autophagy;Autophagosome;LC3;GABARAP;LIR;In vivo;Selective Autophagy;